microscopisch onderzoek

Om de eigenschappen van de bacterie(cel) te onderzoeken moet je van de bacterie(cultuur) of het monster dat je wil onderzoekt een preparaat voor de microscoop maken.
Daarna kan het preparaat (de bacteriecellen) ook nog gekleurd worden om een beter contrast te krijgen van de cel met zijn omgeving.

Hieronder de methoden:

Ongekleurd dekglaspreparaat

De meest eenvoudige methode om micro-organismen te observeren is m.b.v. een dekglas- of waterpreparaat. Het laat de organismen in levende lijve zien zonder eventuele vervormingen of veranderingen in grootte als gevolg van fixatie en kleuring. Een nadeel is dat er vooral bij bacteriën weinig contrast is met de omgeving. Reden om deze preparaten onder een fase-contrast- of donkerveldmicroscoop te bekijken.

UITVOERING

Wees tijdens onderstaande procedure bedacht op besmettingsgevaar, laat een preparaat niet onbeheerd liggen.

Merk het schone, vetvrije objectglas.

Breng met een steriele pasteurpipet of entnaald een druppel vloeistof(cultuur). op het objectglas.

Betreft het koloniemateriaal, breng dan met een geflambeerde entnaald een druppel fysiologische zout oplossing op het voorwerpglas. Wrijf hierna met de opnieuw uitgegloeide entnaald het koloniemateriaal aan de rand van de druppel uit en suspendeer het in de vloeistof.

Zet een schoon dekglas schuin op het objectglas en laat dit (ondersteund door bv. een entnaald) langzaam zakken waardoor de vorming van luchtbellen wordt voorkomen.

Snelle uitdroging wordt voorkomen door het preparaat te omranden met nagellak of vaseline.

Beoordeel het preparaat en breng hierna het objectglas in 70% ethanol en het dekglas in een stafilexoplossing.

Gekleurd dekglaspreparaat (vitaalkleuring)

In dit geval worden de bacteriën gekleurd zonder dat ze (op korte termijn) vergiftigd worden.

UITVOERING

Meng het te onderzoeken materiaal met een entoog methyleenblauw(0,01%) of kristalvioletoplossing(=O,05%).

Voor de rest verloopt de uitvoering als boven beschreven bij het dekglaspreparaat.

Hangende druppel preparaat

Om de beweeglijkheid van micro-organismen te beoordelen gebruikt

men bij voorkeur dit preparaat.

UITVOERING

Neem een schoon objectglas met uitgeslepen holte (Koch-glas). Breng rond deze uitholling een dunne ring vaseline aan:

Neem een schoon dekglaasje en leg in het midden een druppel bacterie-suspensie met behulp van een entoog:

Leg nu het objectglas op het dekglas zodanig dat de uitholling zich boven de druppel bevindt. Druk het objectglas voorzichtig aan voor een goede afsluiting:

Draai nu het geheel om zodat de dekglaszijde boven komt en de druppel hangt:

Beoordeel het preparaat door de rand van de druppel in het centrum van het gezichtsveld van een klein objectief te brengen en scherp te stellen. Draai vervolgens het 40x objectief voor en bekijk hier het preparaat mee:

Gekleurde preparaten

Het maken en fixeren van een preparaat voor een kleuring

De meeste kleuringen gebeuren nadat het preparaat op onderstaande wijze is gemaakt en gefixeerd, dit geldt in het bijzonder voor bacteriën en gisten. Bij het hanteren van culturen en klinisch materiaal wordt zoals gebruikelijk de entoog geflambeerd evenals het glaswerk bij het openen en sluiten.

UITVOERING

Houd het preparaat vast met een pincet.

Op een objectglas kunnen meerdere preparaten gemaakt worden.

Vast materiaal : klik voor animatie op

Neem een schoon, vet- en stofvrij objectglas en merk dit.

Leg er met een entoog een druppel vloeistof op: bij voorkeur fysiologische zoutoplossing (0,9% NaCL), (1O % formaline of water).

Neem een kleine hoeveelheid van het te bekijken materiaal en wrijf het aan de rand van de druppel uit, suspendeer het in de vloeistof en strijk uit over een groot oppervlak (ca 2 cm²),denk aan spatgevaar:

MENG VOORZICHTIG, HOUDT DE ENTOOG IN DE VLOEISTOF

Laat het uitstrijkje drogen op een veilige plaats aan de lucht, boven een kleine vlam of op een droogplaatje bij een lage stand. Teken op de achterzijde van het objectglas de plaats van het preparaat aan door het omcirkelen met viltstift of met een kraspen , Codeer je preparaat. Je kunt meerder uitstrijkjes op één objectglas maken.

Fixeer het preparaat door het driemaal langzaam door de vlam te halen,.

Vloeistoffen

Breng een of meerdere druppels vloeistof op het objectglas (bacteriën goed suspenderen, zo nodig sediment nemen of centrifugeren).

Verspreid de vloeistof over een klein oppervlak, Zie verder onder vanaf

Het kleuren van preparaten

Na fixatie zijn een groot aantal kleuringen mogelijk, elk met hun eigen doel en uitvoering. Toch zijn er ook overeenkomsten die hieronder besproken worden zodat de voorschriften van de verschillende kleuringen zo kort mogelijk gehouden kunnen worden.

UITVOERING

Bedek het de voorgeschreven tijd met de kleurstofoplossing.

Wees voorzichtig met kleurstoffen, vermijd contact met de huid en gebruik zo weinig mogelijk

Spoel na afloop de kleurstof af door een zachte straal kraanwater over de achterzijde van het preparaat te laten lopen zodat de micro-organismen er indirect mee in contact komen.

Droog het preparaat door het schuin op filtreerpapier te zetten en aan de lucht te laten drogen of door het tussen filtreerpapier voorzichtig droog te deppen.

Bekijk het preparaat zonder dekglas onder de olie-immerssielens (uiteraard via de nodige tussenstappen),

Het maken van een verzadigde kleurstofoplossing.

Voor het bereiden van kleurstofoplossingen wordt meestal uitgegaanvan verzadigde alcoholische oplossingen, daar deze onbeperkt houdbaar zijn. Deze bevatten 5 gram kleurstofpoeder opgelost in 95 ml ethanol 96%.

UITVOERING

Weeg 5 gram kleurstof af.

Breng de kleurstof in een mortier en wrijf in een kleine hoeveelheid alcohol de kleurstof goed fijn tot een homogene dunne brei.

Voeg, al mengend,langzaam de rest van de alcohol toe.

Giet over in een bruine fles.

Schud de oplossing goed en laat 24 uur rusten.

Het beoordelen van een preparaat.

Om een goede indruk van het te beoordelen materiaal te krijgen moet een geschikt deel van het preparaat bekeken worden d.w.z.. een gedeelte dat niet te dik of te dun is en waar zich geen storende kleurstof resten o.i.d. bevinden. Bekijk verschillende gezichtsvelden en let hierbij op vorm, onderlinge rangschikking en grootte van de cellen. Teken enkele cellen tijdens het microscopiseren. Kijk ook naar de structuren in of om de cel, vooral als dit het doel van de kleuring is. Soms is ook de hoeveelheid cellen per gezichtsveld van belang maar een echte telling is niet zinvol. Wel kan de onderlinge getalsverhouding tussen verschillende soorten cellen van belang zijn.

Methyleenblauw kleuring

UITVOERING: klik voor animatie op

Kleur het gefixeerde preparaat 2-3 minuten met Loeffler^’s methyleen-blauw oplossing.

Spoel af met water, droog.

Resultaat :blauwe cellen

Reagentia:

Loeffler’s methyleenblauwoplossing

Voeg 30 ml verzadigde alcoholische methyleenblauwoplossing toe aan 100 ml 0,1% KOH oplossing en filtreer.

Gramkleuring

Dit is een differentiële kleuring: je kunt onderscheid maken, het is een eerste stap bij de identificatie van bacteriën. Hiervan zijn vele variaties. Deze is vanwege de houdbaarheid van de kristalviolet oplossing het meest geschikt voor gebruik op school. Het is de gramkleuring volgens Hucker, waarbij als tegenkleurstof voor saffranine is gekozen i.p.v. fuchsine (carcinogeen?).
Let op! Alleen jonge culturen gebruiken, veroudering en verzuring maakt grampositieve bacteriecellen gramnegatief
Op de foto hier rechts grampostieve cellen en gramnegatief geworden cellen in een oude cultuur van Staphylococcus aureus.

UITVOERING : klik voor animatie op

Kleur met kristalviolet: 1 minuut

Afgieten, niet spoelen

Kleur met lugol : 1 minuut

Afgieten, niet spoelen met water

Spoel met ethanol 96%

Laat alcohol inwerken : 1 minuut

Spoel met water

Kleur met saffranine : 1 minuut

Spoel met water

Droog het preparaat.

Resultaat: grampositieve bacteriën paarsblauw,

gramnegatieve bacteriën lichtrood

Reagentia gramkleuring

Hucker's kristalvioletoplossing:

Maak 80 ml 10% ammoniumoxalaatoplossing in water. Los de stof op door het een nacht in water te laten staan en/of te verwarmen. Voeg hieraan toe:1O ml alcoholische verzadigde kristalvioletoplossing en 10 ml 96% ethanol. Laat 2 dagen staan en filtreer door een nat filter.

Lugol:

Weeg 1 gram jodium af en 2 gram kaliumjodide. Breng dit in een mortier, wrijf het fijn en los het geleidelijk op in 500 ml gedestilleerd water.

Saffranine (0,5%)

Voeg aan 90 ml gedestilleerd water 10 ml verzadigde alcoholische saffranineoplossing toe. Filtreer door een nat filter.

Sporenkleuring met Hucker's kristalviolet-oplossing

Deze kleuring heeft als doel eventuele endosporen van bacteriën door het kleuren van de omgevingzichtbaar te maken:de sporen zelf blijven ongekleurd, de moedercel wordt gekleurd.

UITVOERING

Kleur een gefixeerd preparaat 1 minuut met Hucker’s kristalviolet-oplossing.

Spoel af en droog

Resultaat :paarse cellen, kleurloze sporen, alleen te zien als een “gat” in de cel.

Reagentia:

Hucker’s kristalvioletoplossing: zie gramkleuring.

Sporenkleuring volgens Schaeffer en Fulton

Bij deze kleuring worden de endosporen van bacteriën en de ascosporen van gisten gekleurd. Ook losse sporen zijn zichtbaar dit i.t.t. de vorige kleuring.

UITVOERING: klik voor animatie op

Kleur het gefixeerde preparaat 2, minuten onder verwarming, boven hete waterdamp, bijvoorbeeld kokend water) met de malachietgroen-oplossing. Zorg ervoor dat er stoom van het preparaat komt maar laat de vloeistof niet koken, voeg nieuwe vloeistof toe als het preparaat dreigt in te drogen.

Spoel het preparaat grondig met water.

Kleur 30 seconden na met een waterige saffranine-oplossing.

Spoel en droog.

Resultaat; rode cellen, groene sporen.

Reagentia

Malachietgroenoplossing in gedestilleerd water.

Saf£ranine 0,5% in gedestilleerd water.

Negatieve kleuring met Oost-Indische inkt

In deze kleuring wordt niet de cel maar de omgeving gekleurd.

UITVOERING

Leg op de linkerkant van een objectglas een druppel Oost-Indische inkt of nigrosine.

Leg hiernaast een druppel fysiologische zoutoplossing en suspendeer hierin het bacteriemateriaal.

Strijk verder uit tot een dunne film m.b.v. entoog of een tweede objectglas:

Droog het preparaat aan de lucht.

Probeer bij de uitstrijk een gradatie in dikte te krijgen:

Resultaat: lichte cellen, donkere achtergrond

Reagentia:

Oost-Indische inkt vermengd met een gelijke hoeveelheid demiwater en 15 minuten gecentrifugeerd bij 2500 rpm

Kapselkleuring volgens Burri

Behalve de omgeving wordt hier ook de cel gekleurd zodat het kapsel hiertussen als een ongekleurde ring te zien is.

UITVOERING

Zie bovenstaande kleuring

Fixeer het preparaat 5 minuten met methanol 96%( i.p.v. verhitten)

Spoel af en kleur. 1 minuut met verdunde carbolfuchsine-oplossing of methyleenblauw.

Spoel af met water en laat drogen

Resultaat: roze cellen, kleurloos kapsel, zwartgrijze achtergrond

Reagentia:

O.I.inkt zie bovenstaande methode

Carbolfuchsine verdun carbolfuchsine voor de Ziehl-Neelsenkleuring 1:5 met gedestilleerd water.

Methyleenblauw :volgens Loeffler

Zuurvast kleuring volgens Ziehl-Neelsen

Deze kleuring wordt gebruikt om zuurvaste bacteriën te onderscheiden van niet-zuurvaste bacteriën.

UITV0ERING

Bedek een gefixeerd preparaat met gefiltreerde carbol-fuchsine-oplossing, verwarm tot dampvorming en laat 2 minuten inwerken.

Spoel af met water.

Ontkleur 5 minuten in zoutzure ethanol.

Spoel af met water(zeer grondig).

Kleur 1 minuut met een methyleenblauwoplossing.

Spoel af met water en droog.

Resultaat :zuurvaste bacteriën rood, andere bacteriën blauw.

Reagentia:

Ziehl-Neelsen carbolfuchsine-oplossing:

Los 0,3 gram basische fuchsine op in 10 ml ethanol 96%, los 5 g fenol op in 95 ml gedestilleerd water. Meng beide oplossingen. Voor gebruik filtreren.

Zoutzure ethanol:meng 5 ml zoutzuur 25/o met 95 ml ethanol 96%.

PHB kleuring.

Met deze kleuring zijn reservestofkorrels met poly-b-hydroxyboterzuur aan te tonen.

UITVOERING

Bedek een gefixeerd preparaat met Sudan Black B-oplossing en laat de oplossing 10 minuten inwerken zonder dat het preparaat droogvalt.

Laat de overmaat kleurstof er aflopen en droog tussen filtreerpapier totdat alle kleurstof is opgezogen.

Voeg enkele druppels xyleen toe, laat even inwerken en dep droog.

Kleur 15 seconden met saffranine.

Spoel met water en droog.

Resultaat PHB korreltjes zijn als grijs-zwarte bolletjes in het plasma te zien.

Reagentia:

Sudan Black B oplossing: Los 0,3 gram Sudan Black B op in 75 ml ethanol 96%. Voeg 25 ml water toe en schud goed.

0,5% safranine-oplossing in water

Bron: http://www.microbiologie.info